背景：獸藥典規(guī)定無(wú)菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基靈敏性驗(yàn)證時(shí)接種相應(yīng)質(zhì)控菌菌落數(shù)為1-50CFU，這個(gè)范圍較廣，不能精確得驗(yàn)證培養(yǎng)基得靈敏性，故為了更精確得對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，確定其最小檢出量，特進(jìn)行此方法驗(yàn)證。

名稱	質(zhì)控菌
流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）	金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌
酪胨瓊脂（GA）	金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌
葡萄糖蛋白胨（GP）	白色念珠球菌、黑曲霉菌

材料：

名稱	廠家	批號(hào)	名稱		批號(hào)	活菌數(shù)	規(guī)格
流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）	中海生物	150420	金黃色葡萄球菌	自制	201301	9.5*105CFU/ml	0.5ml/支
酪胨瓊脂（GA）	中海生物	151123	銅綠假單胞菌	自制	201301	8*106 CFU/ml	0.5ml/支
葡萄糖蛋白胨（GP）	中海生物	151026	白色念珠球菌	自制	201301	1.6*104 CFU/ml	0.5ml/支
蛋白胨	OXO	869398	生孢梭菌	自制	201301	8*104 CFU/ml	0.5ml/支
營(yíng)養(yǎng)瓊脂	中海生物	160229	/	/	/	/	/

/主要試劑配方

3.1 硫乙醇酸鹽（TG）培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基30g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。

3.2 酪胨瓊脂（GA）培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基42g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。

3.3葡萄糖蛋白胨（GP)培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基28g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。

3.4 半固體TG培養(yǎng)基：分別取TG培養(yǎng)基30g、GA培養(yǎng)基1g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。

3.5 0.1%蛋白胨水：取1g胰蛋白胨，加入100ml MILLIPORE水，溶解后121℃ 滅菌15min，放置室溫后，置2-8℃保存。

實(shí)驗(yàn)方法

4.1 GA/TG培養(yǎng)基最小檢出量實(shí)驗(yàn)

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌用0.1%蛋白胨水還原后，分別按照表3進(jìn)行稀釋，取理論菌落數(shù)為1CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml、15CFU/0.2ml、20CFU/0.2ml得稀釋度,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌每個(gè)稀釋度分別接種TG、 6支，每支0.2ml,3支置25℃培養(yǎng)箱，另3支置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7日，每天觀察小管污染情況并記錄；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種GA斜面6支，每支0.2ml,3支置25℃培養(yǎng)箱，另3支置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7日，每天觀察小管污染情況并記錄。

同時(shí)金黃色葡萄球菌每個(gè)稀釋度接種2副營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培養(yǎng)。

銅綠假單胞菌每個(gè)稀釋度接種2副酪胨瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培養(yǎng)。

生孢梭菌每個(gè)稀釋度接種2管半固體TG培養(yǎng)基，每管0.2ml菌液,置37℃培養(yǎng)。

TG/GA小管配制日期：2016.03.21

接種日期：2016.03.23

表3 銅綠假單胞菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌最小檢出量驗(yàn)證稀釋方法

銅綠假單胞菌

管號(hào)

原瓶

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

10

11

稀釋液ml

1ml

4.5

9

9

9

9

7.4

6

7

5

6

加樣量

/

取原瓶0.5

取①1

?、?

?、?

取④1

?、?

?、?

?、?/p>

?、?

?、?.5

取⑥1

CFU/ml

4*106

4*105

4*104

4*103

400（計(jì)數(shù)）

75（計(jì)數(shù)）

35（計(jì)數(shù)）

100

75

50

25

5

CFU/0.2ml

/

/

/

/

/

/

/

20

15

10

5

1

生孢梭菌

管號(hào)

原瓶

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

/

/

稀釋液ml

1ml

4.5

9

9

9

3

4.3

7

2.4

4

/

/

加樣量

/

取原瓶0.5

?、?

?、?

取③1

?、?

?、?

取②1

?、?

?、?

/

/

CFU/ml

4*104

4*103

400

40

4

100

75

50

25

5

/

/

CFU/0.2ml

/

/

/

/

/

20

16

10

5

1

/

/

金黃色葡萄球菌

管號(hào)

原瓶

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

⑨

/

/

稀釋液ml

1ml

4.5

4.5

4.5

3.75

5.2

4.25

4.25

2

4.5

/

/

加樣量

/

取原瓶0.5

?、?.5

取②0.5

?、?

?、?

取③0.5

?、?.5

?、?

取⑦0.5

/

/

CFU/ml

4.75*105

4.75*104

4.75*103

4.75*102

100

75

50

50

25

5

/

/

CFU/0.2ml

/

/

/

/

20

15

10

10

5

1

/

/

4.2 GP培養(yǎng)基最小檢出量實(shí)驗(yàn)

將白色念珠球菌用0.1%蛋白胨水還原后，分別按照表4進(jìn)行稀釋，取理論菌落數(shù)為1CFU/0.2ml、2CFU/0.2ml、4CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml得稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種GP斜面 3支，每支0.2ml置25℃培養(yǎng)箱，每天觀察小管污染情況并記錄。同時(shí)每個(gè)稀釋度接種2副酪胨瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。

GP小管配制時(shí)間：2016.04.08

檢驗(yàn)日期：2016.04.09—2016.04.16

表4 白色念珠菌最小檢出量驗(yàn)證稀釋方法

白色念珠菌	管號(hào)	原瓶	①	②	③	④	⑤	⑥	⑦	⑧
	稀釋液ml	1ml	4.5	9	4.5	4.4	3	7	1.8	1.8
	加樣量	/	取原瓶0.5	?、?	?、?.5	取②2	?、?	?、?	?、?	取②3
	CFU/ml	8000	800	80	8	25	20	10	5	50
	CFU/0.2ml	/	/	/	/	5	4	2	1	10
	接種管號(hào)	/	/	/	/	√	√	√	√	√

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基最小檢出量得實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照4.1得實(shí)驗(yàn)方法，確定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中得最小檢出量，結(jié)果見(jiàn)表5、表6、表7。

表5 金黃色葡萄球菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中得最小檢出量

時(shí)間	最終接種菌數(shù)（CFU）
	1		5		10		15		20
	37℃	25℃	37℃	25℃	37℃	25℃	37℃	25℃	37℃	25℃
第1天（+）	3/3	0/3	3/3	0/3	3/3	0/3	3/3	0/3	3/3	0/3
第2天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第3天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第4天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第5天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第6天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
第7天（+）	3/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
培養(yǎng)結(jié)果	1/3		3/3		3/3		3/3		3/3
計(jì)數(shù)菌數(shù)（CFU)	1,0		3,4		12.18		16.16		20,22

表6銅綠假單胞菌和生孢梭菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中得最小檢出量

時(shí)間

生孢梭菌最終接種菌數(shù)（CFU）

銅綠假單胞菌最終接種菌數(shù)（CFU）

1

5

10

15

20

1

5

10

15

20

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

第1天（+）

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

1/3

0/3

2/3

0/3

3/3

1/3

3/3

0/3

3/3

0/3

第2天（+）

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第3天（+）

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第4天（+）

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第5天（+）

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第6天（+）

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第7天（+）

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

培養(yǎng)結(jié)果

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

計(jì)數(shù)菌數(shù)（CFU)

2,2

9，10

26,24

29

37

0,0

0,0

6,4

2,2

4,8

結(jié)果表明：硫乙醇酸鹽對(duì)金黃色葡萄球菌得最小檢出量為3CFU、對(duì)生孢梭菌最小檢出量為2CFU、對(duì)銅綠假單胞菌得最小檢出量為2CFU。

備注：理論接種菌落數(shù)與同步計(jì)數(shù)菌落數(shù)有一定差異，結(jié)論以實(shí)際計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。

銅綠假單胞菌實(shí)際結(jié)果與計(jì)數(shù)結(jié)果差異較大，2次重復(fù)試驗(yàn)均如此。

5.2 酪胨瓊脂培養(yǎng)基最小檢出量得實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照4.1得實(shí)驗(yàn)方法，確定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中得最小檢出量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中得最小檢出量

時(shí)間

金黃色葡萄球菌最終接種菌數(shù)（CFU）

銅綠假單胞菌最終接種菌數(shù)（CFU）

1

5

10

15

20

1

5

10

15

20

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

37℃

25℃

第1天（+）

0/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

0/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

3/3

0/3

第2天（+）

2/3

1/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

0/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第3天（+）

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

0/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第4天（+）

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

0/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第5天（+）

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第6天（+）

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

第7天（+）

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

1/3

3/3

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

培養(yǎng)結(jié)果

2/3

3/3

3/3

3/3

3/3

1/3

2/3

3/3

3/3

3/3

計(jì)數(shù)菌數(shù)（CFU)

1,0

3,4

12.18

16.16

1,0

0,0

0,0

6,4

2,2

4,8

結(jié)果表明：酪胨瓊脂培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌得最小檢出量為3CFU、對(duì)銅綠假單胞菌得最小檢出量為2CFU。

5.3 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基最小檢出量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照4.2得實(shí)驗(yàn)方法，確定白色念珠球菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中得最小檢出量，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 白色念珠菌在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中得最小檢出量

時(shí)間	白色念珠菌最終接種菌數(shù)（CFU）
	1	2		4	5		10
	25℃		25℃	25℃		25℃	25℃
第1天（+）	0/3		0/3	0/3		0/3	0/3
第2天（+）	0/3		0/3	0/3		0/3	0/3
第3天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第4天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第5天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第6天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
第7天（+）	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
觀察結(jié)果	1/3		3/3	3/3		3/3	3/3
計(jì)數(shù)菌數(shù)（CFU)	0，0		0，0	1，0		1，1	3，3

結(jié)果表明：葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)白色念珠球菌得最小檢出量為1CFU。

結(jié)論與分析

1.理論接種菌落數(shù)與同步計(jì)數(shù)菌落數(shù)差異問(wèn)題 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，理論接種菌落數(shù)與同步計(jì)數(shù)菌落數(shù)有一定差異，其中以銅綠假單胞菌差異蕞大。目前還未找到原因。因?yàn)橥接?jì)數(shù)菌落數(shù)比理論菌落數(shù)更加接近實(shí)際得菌落數(shù)，因此最小檢出量以同步計(jì)數(shù)菌落數(shù)來(lái)計(jì)算。

2.最小檢出量得管數(shù)判定問(wèn)題 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)稀釋度均接種3個(gè)對(duì)應(yīng)得培養(yǎng)基小管，在培養(yǎng)結(jié)束后判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，是按照3/3全部污染為標(biāo)準(zhǔn)?？墒蔷鋽?shù)較少得稀釋度并不是均不污染，而是污染2/3、1/3管。根據(jù)此現(xiàn)象，推測(cè)是因?yàn)榧?xì)菌在樣品中數(shù)量太少，而接種時(shí)只吸取0.2ml接種，若0.2ml里有菌落，則能夠檢出；若0.2ml里剛好沒(méi)有吸到菌落則檢不出來(lái)。因此，若認(rèn)為每次接種均能夠吸取菌落，則按照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則每一種培養(yǎng)基得最小檢出量均為1個(gè)CFU。

名稱	質(zhì)控菌	3/3管最小檢出量	2/3管最小檢出量	1/3管最小檢出量
流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）	金黃色葡萄球菌	3CFU	/	1CFU
	銅綠假單胞菌	2CFU	1CFU	1CFU
	生孢梭菌	2CFU	/	/
酪胨瓊脂（GA）	金黃色葡萄球菌	3CFU	/	1CFU
	銅綠假單胞菌	2CFU	1CFU	1CFU
葡萄糖蛋白胨（GP）	白色念珠球菌	1CFU	1CFU	1CFU

3.增大無(wú)菌檢驗(yàn)檢出率得措施

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，在無(wú)菌檢驗(yàn)過(guò)程中因取樣量得原因確實(shí)會(huì)出現(xiàn)漏檢得機(jī)率，可以加大接種量（小管接種從0.2ml加大到0.5ml，小瓶從1ml加大到5ml）避免漏檢。對(duì)于半成品檢驗(yàn)來(lái)說(shuō)，二檢抗原制定合理得取樣接種時(shí)間也十分重要。